Questo nuovo assetto mise profonde radici nella città e nella regione, cancellando definitivamente lo spirito particolaristico che nella repubblica fiorentina del 1527-1530 aveva avuto l'ultima manifestazione di rilievo.
Fu Alessandro de' Medici, duca di Firenze dal 1532, ad iniziare l'opera di annullamento delle residue forze signorili che avevano sostenuto la repubblica e osteggiato il principato.
Dopo il suo assassinio (1537), Cosimo I ne continuò e potenziò la politica, mantenendo in vita formalmente alcuni istituti repubblicani, ma svuotandoli di fatto e sottraendoli comunque al controllo delle grandi famiglie.

Cosimo I, che ottenne nel 1569 dal papa Pio V il titolo di Granduca di Toscana, sviluppò la politica di consolidamento del potere di Firenze sull'intera regione, vincendo la guerra contro Siena (1554-1555) e intervenendo in modo determinante nella politica interna di Lucca (1546).
La repubblica di Lucca, infatti, conservò la sua autonomia ma rimase costretta ad una limitata politica priva di sbocchi, e con essa rimasero al di fuori del principato fiorentino Massa e Carrara, Piombino, lo Stato dei Presidi e la contea di Pitigliano.
Sulla restante regione, il dominio di Cosimo si instaurò senza più contrasti, con una struttura unitaria, anche se giuridicamente e amministrativamente il territorio era diviso tra "Stato vecchio" (Firenze e i suoi territori) e " Stato nuovo" (Siena).
Dopo la morte del Granduca, con Ferdinando I (1587-1609) si ebbe una ripresa dell'energica politica di Cosimo I, e la Toscana e si affacciò alla grande politica europea, tentando di sottrarsi all'egemonia spagnola, mediante un avvicinamento alla Francia (la figlia di Francesco, Maria, andò sposa a Enrico IV di Francia), e contrastando l'espansione dello Stato sabaudo.

Tra il 1609 e il 1670, il granducato attraversò una fase di ristagno e un forte indebolimento sul piano internazionale, poiché la Spagna prese il controllo della politica estera del granducato, e sul piano economico, l'evidente fase di regressione si accentuò sotto i due successivi granduchi, Cosimo III (1670-1723) e Gian Gastone (1723-1737).
Con l'estinguersi della dinastia dei Medici, la regione fu assegnata dapprima (1718) a Carlo, figlio di Filippo V di Spagna, e passò poi sotto il dominio di Francesco Stefano di Lorena (1737-1765), marito della futura imperatrice Maria Teresa.
Sotto la nuova dinastia, il granducato, anche se ridotto a provincia dell'Impero austriaco, beneficiò delle riforme illuminate degli Asburgo: furono abolite le dogane interne e l'agricoltura toscana venne fortemente incentivata.

Occupata dalla Francia nel 1799, e poi riconquistata dagli Austriaci, la Toscana fu assegnata, in base al trattato di Lunéville, a Ludovico I di Borbone (1801-1803), con la denominazione di regno d'Etruria. Ma, una volta annessa all'Impero napoleonico (1807), fu ricostituita in granducato per Elisa Bonaparte Baciocchi (1809-1814).

La dominazione napoleonica portò riforme e miglioramenti amministrativi fino al 1814, quando, dopo una breve occupazione da parte delle truppe di Murat, il congresso di Vienna restituì il granducato a Ferdinando III.
Sotto Leopoldo II (1824-1859), nonostante le pressioni reazionarie dell'Austria, il clima tollerante fece della Toscana un rifugio per gli esuli politici degli altri Stati italiani, ed il centro di un movimento liberale riformatore.

Nel 1848, dopo l'instaurazione del regime costituzionale, il granduca Leopoldo II dovette permettere la partecipazione delle sue truppe regolari e di volontari alla prima guerra d'Indipendenza contro l'Austria. Dopo il fallimento della campagna militare, però, si ebbe anche in questa regione l'affacciarsi di un forte movimento democratico ed un nuovo ministero chiese la convocazione di un'assemblea costituente nazionale a Roma.

Dopo l'intervento delle armi austriache (luglio 1849), avvenne però la rottura della collaborazione tra i moderati e il granduca; e presero quindi forza le correnti filosabaude, che facevano capo alla Società nazionale di La Farina, da una parte, e, dall'altra, i gruppi mazziniani.

Con la guerra del 1859, il dominio di Leopoldo fu però investito da una crisi definitiva, che portò il reggente all'esilio (27 aprile 1859), mentre a Firenze il governo provvisorio di Ubaldino Peruzzi offrì la regione alla dittatura a Vittorio Emanuele II.

Vittorio Emanuele accettò, per ragioni di politica internazionale, solo il protettorato e, in seguito all'armistizio di Villafranca, impose la monarchica sabauda, definita il 15 marzo 1860 dal plebiscito che scelse Vittorio Emanuele II.